question à propos de CLHP.....?

Question

salut
je dispose d'un extrait (DCM/MeOH 50/50) d'un plante que j'ai purifié sur colonne, je souhaite réaliser la CLHP (qualitative) de deux de mes fractions : l'une obtenue avec un mélange MeOH/H2O 80:20 et l'autre avec l'acétonitrile
je ne dispose que d'une colonne C18  de 15 cm , 4,6 micons, je voudrais avoir une idée sur la phase mobile à utiliser pour chaque fraction et ma longueur d'onde de détection (je n'ai aucune idée sur la composition de mes fractions, mais elles referment surement plusieurs produits)
mon idée première est d'utiliser un mélange MeOH/eau pour la 1ère fraction (en testant plusieurs pourcentages) et un mélange ACN/eau pour la deuxième, ma détection serait à 210 nm...
ai-je raison?

CJay · Accepted Answer

D’abord il faudrait se mettre en phase avec le vocabulaire. J’ai beaucoup de mal à voir ce que tu appelles fractions. Normalement il doit s’agir des récipients dans lesquels tu as collecté ta phase mobile en sortie de colonne. Comment peux-tu avoir un extrait DCM/MeOH (1 :1) si tu élues avec un mélange MeOH/eau ou avec acetonitrile. As-tu changé de phase de mobile au cours de ta purification. As-tu fait 2 colonnes?

Bref ! Ce que je peux dire c’est que, logiquement, si tes conditions de séparation sont efficaces en préparative, elles doivent l’être en qualitative (en général on teste d’abord en qualitatif avant de faire en prép mais bon...). Logiquement encore tu ne devrais pas avoir besoin de 2 phases mobiles pour analyser tes composés sur la même colonne…
Visiblement tu travailles en phase inverse (colonne C18) donc je te conseille de faire un gradient en utilisant un mélange binaire eau + 0.05% TFA (acide trifluoroacétique 5 mL dans un litre d’eau) /acétonitrile. En effet, tes extraits contiennent surement des fonctions acido-basiques en en ionisant certaines tu auras une meilleure séparation. Ensuite tu fais un gradient. Pour la longueur d’onde, essayes les toutes car tu ne sais pas comment ton produit (et les impuretés) va répondre. Et puis chauffe le four pour diminuer la viscosité (et garder les produits en solution). Compte-tenu de ta colonne je te suggère cette méthode:

Solvant A : eau + 0.05% TFA
Solvant B : acétonitrile
Debit : 1 mL/mn
Temp : 70C
Stop : 13 mn
Longueur d’onde : 210, 225, 254 nm 

Gradient
t(min)     A      B
0           95     5
1.5        95     5
8.5        5      95
10         5      95
10.1      95    5
13         95    5

Ensuite adapte les paramètres (ou la colonne) selon les temps de rétention que tu obtiendras.

Sinon voila de quoi t’aider sur le principe :
http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/Physique/CHIM/Jumber/HPLC/Chromatographie_en_phase_liquide.htm

Edit : ok je comprends mieux. Moi à ta place j’aurais juste fait un gradient de MeOH (20% à 100%) mais bon si ca marche comme tu as fait…
Pour ce qui est de l’analyse la méthode que je t’ai donnée devrait marcher. Assure-toi juste que ton échantillon est limpide avec une concentration suffisante (au moins 1 mg/mL pour un volume d’injection de 5 uL). Ajoute qq gouttes de DMSO si tu as des matières en suspension.
Le site choix pour le développement de méthodes analytiques c’est EARL (Electronic Analytical Reference Library). Voici le lien :
http://www.earl2learn.com/

frenchbaldman · Answer

Je te conseille de te procurer le manuel de chromatographie liquide à haute performance de Robert ROSSET et collègues, chez DUNOD. Un bouquin très complet dans lequel tu trouveras une grande quantité de tuyaux.
As-tu une idée de la nature chimique de tes composés extraits?
N'oublie pas non plus la possibilité de faire des gradients d'élution.

Anonyme · Answer

belles fetes de fin d'année, mister calendrier (lol)...On ne peut pas plaire a tout le monde, tu sais..alors interesse toi a ceux qui t'estime, qui t'apprécie...-;) bécotsssss

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